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L’uso del Next Generation Sequencing per definire l’origine della mielofibrosi primaria

Commento a cura della Dott.ssa Debora Luzi

Le neoplasie mieloproliferative (MPN) croniche sono disordini clonali che originano da progenitori staminali emopoietici. La mielofibrosi primaria (PMF) è caratterizzata da alcuni aspetti peculiari, come la produzione aberrante di megacariociti, l’emopoiesi extramidollare, la presenza di fibrosi midollare e la possibile evoluzione in leucemia acuta. Alcuni studi suggeriscono che la cellula da cui origina la patologia sia la cellula staminale ma resta ancora da chiarire in quale fase del processo emopoietico essa sia realmente collocata e, in particolare, se rappresenta la cellula staminale emopoietica multipotente o il progenitore commissionato verso la linea mieloide.
L’impiego di tecnologie di sequenziamento di nuova generazione, Next Generation Sequencing (NGS), consente di ottenere informazioni sul DNA genomico, in particolare sull’esoma e sui geni mirati. In questo articolo, l’NGS viene impiegato per studiare le cellule mieloidi e linfoidi dei pazienti affetti da PMF, verificando che le alterazioni genetiche della patologia si verificano in uno stadio precoce della differenziazione staminale emopoietica, spiegando così la possibile trasformazione della malattia in leucemia acuta mieloide o linfoide.

Background

La mielofibrosi primaria (PMF) è una neoplasia mieloproliferativa (MPN) cronica caratterizzata da sclerosi progressiva del midollo osseo (MO), emopoiesi extra-midollare e possibile trasformazione in leucemia acuta. Studi genetici e genomici hanno fornito prove molecolari alla base della patogenesi delle PMF, ma rimane ancora da comprendere l’origine linfoide o mieloide della malattia. Nello studio di Visani et al. vengono indagate, attraverso l’impiego della Next Generation Sequencing (NGS), le alterazioni genetiche presenti sia nelle cellule mieloidi sia in quelle linfoidi, nonché il DNA non neoplastico dei pazienti con PMF.

Introduzione

Le neoplasie mieloproliferative (MPN) Ph- comprendono la mielofibrosi primaria (PMF), una malattia ematologica cronica caratterizzata da:

Stadio pre-fibrotico/precoce
Midollo osseo (MO) ipercellulare
Stadio fibrotico

• Marcata fibrosi del MO
• Clinicamente caratterizzato da
leuco-eritroblastosi nel sangue,
epatomegalia e splenomegalia

% mutazioni genetiche
Next Generation Sequencing (NGS)
Ha rilevato alterazioni molecolari sul DNA libero da cellule (cfDNA) e sul DNA di granulociti accoppiati su campioni di plasma di pazienti con MPN
Geni driver (JAK2, MPL, CARL)
+ TET2, ASXL1, SRSF2, IDH2, SF3B1 e EZH2
Per definire l’evoluzione clonale delle neoplasie mieloproliferative è stato eseguito il sequenziamento dell’intero esoma sia alle cellule mieloidi sia a quelle linfoidi di pazienti con PMF
Materiali e metodi
Selezione del caso
N = 12 PMF
Isolamento e purificazione delle cellule mieloidi e linfoidi dal sangue periferico
• Separazione per gradiente di densità
• Isolamento mediante marcatura immunomagnetica delle cellule CD3+
• Analisi cito-fluorimetrica
Sequenziamento esoma
• Estrazione DNA
• Sequenziamento mediante Illumina HiScan SQ
Validazione mediante sequenziamento Sanger
Per confermare l’efficienza di WES, è stato analizzato il DNA estratto dai granulociti e dai linfociti
Risultati

Le aberrazioni genetiche scoperte includevano sia SNV (3000) sia InDel

Tra i nuovi SNV sono state trovate 142 mutazioni missenso e 4 stop-gain in tutti i pazienti
Le mutazioni evidenziate sono state riscontrate a carico di geni con importanti ruoli nel cancro o nella regolazione della trascrizione proteica

IFI16
ERBB4
FGFR2
AMFR
UBA2

Sono state riscontrate 101 mutazioni InDel in tutti i pazienti:

Tra i nuovi InDel sono state trovate 14 inserzioni e 13 delezioni

Per chiarire lo stadio ematopoietico in cui si sono verificate le mutazioni,
sono state confrontate le alterazioni riscontrate nei granulociti e nei linfociti
La maggior parte degli SNV era comune tra le due cellule
Il 93% degli SNV era comune tra linfociti
e granulociti
Quasi la metà degli InDel era in comune tra granulociti e linfociti
Per convalidare l’efficacia del WES, è stato eseguito il sequenziamento di Sanger su alcuni geni:
Discussione
Confrontando lo stato mutazionale delle cellule mieloidi e linfoidi è emerso che SNV e InDel erano in comune
Tali mutazioni potrebbero essersi verificate a monte del progenitore mieloide e linfoide, suggerendo una cellula progenitrice multipotente come cellula di origine di questa malattia.
InDel e SNV erano in gran parte distinti nelle componenti mieloide e linfoide, suggerendo la loro comparsa successiva e il possibile ruolo nella progressione della malattia piuttosto che nell’inizio.
Una delle mutazioni più comuni riportate nei pazienti affetti da PMF è stata a carico del gene JAK2 V617F
Questa mutazione è stata evidenziata anche nelle cellule linfoidi, confermando l’ipotesi che tali cellule siano all’origine della PMF.

È stata riscontrata nel 50-60% dei pazienti che non presentavano altre mutazioni (CARL-MPL).

Poiché la PMF mostra un fenotipo mieloproliferativo puro, il rischio di trasformazione mieloide in questa malattia è significativamente elevato
Tale patologia mostra anche una rara associazione con la trasformazione linfoide
In questo studio, oltre all’elevato numero di mutazioni comuni tra le linee mieloidi e linfoidi, sono state riscontrate mutazioni che sembravano essersi sviluppate indipendentemente in ciascun tipo di cellula, cioè che avrebbero potuto verificarsi in una fase successiva durante la differenziazione della linea cellulare. 
Tra i geni mutati nei linfociti vi erano MED25, TAOK2, RERE, ZNF84 e NLRP6 che svolgono un ruolo significativo nella segnalazione cellulare, nella modificazione della cromatina e nell’apoptosi. Queste mutazioni potrebbero spiegare la trasformazione della leucemia linfoblastica in PMF, che è associata all’avvento di nuove espansioni clonali nella malattia.
Conclusioni
La maggior parte delle lesioni genetiche riscontrate nei pazienti con PMF condivide un lignaggio mieloide e linfoide. Ciò implica la loro presenza in un precursore ematopoietico precoce e non commissionato, almeno in una percentuale di casi di PMF, e fornisce un razionale per il possibile verificarsi di una trasformazione blastica mieloide o linfoide.
Visani G, et al. Cancers (Basel). 2023 Mar 15;15(6):1785.
Per maggiori approfondimenti consultare l’articolo originale al seguente link:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10046249/

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